Porcine endogene Retroviren und Xenotransplantation: Evaluierung des Infektionsrisikos und Strategien zur Hemmung der Virusreplikation mittels RNA-Interferenz

Alexander Karlas

ISBN 978-3-8325-1165-4
177 Seiten, Erscheinungsjahr: 2006
Preis: 40.50 €

Der anhaltende Engpass an Allotransplantaten macht die Suche nach einer geeigneten Alternative dringend notwendig. Ein Lösungsansatz besteht in der Transplantation porciner Zellen oder Organe auf den Menschen. Derartige Xenotransplantationen bergen momentan jedoch noch etliche Risiken, wie immunologische Abstoßungsreaktionen oder physiologische Unverträglichkeiten. Zudem besteht die Gefahr einer Übertragung von porcinen Mikroorganismen auf den humanen Rezipienten. Im Unterschied zu den meisten bakteriellen und viralen Erregern des Schweins, die durch Zucht unter keimfreien Bedingungen eliminiert werden können, ist das Genom der porcinen endogenen Retroviren (PERV) mit zahlreichen Kopien stabil im Genom des Schweins integriert. Phylogenetisch verwandte Retroviren, wie die Leukämieviren der Maus (MuLV) und der Katze (FeLV) induzieren im infizierten Tier Leukämien, Tumore und Immundefizienzen und zeigen somit das Gefährdungspotential einer möglichen PERV-Infektion humaner Rezipienten.

Um Xenotransplantationen in Zukunft sicherer gestalten zu können, wurde erstmals das Potential des relativ neu entdeckten Phänomens der RNA-Interferenz hinsichtlich einer antiviralen Strategie gegen die Replikation von PERV analysiert: Mittels Transfektion von unterschiedlichen siRNAs gelang es, eine geeignete Target-Sequenz innerhalb des PERV-Genoms zu identifizieren.Ausgehend von dieser siRNA-Sequenz wurde ein Plasmid mit einer shRNA-Expressionskassette konstruiert, das nach stabiler Transfektion eine starke und dauerhafte Hemmung der PERV-Expression hervorrief. Sowohl die mRNA, die viralen Proteine und vor allem die Menge freigesetzter infektiöser Viruspartikel waren reduziert. Für die Herstellung transgener Schweine mit verminderter PERV-Expression empfiehlt sich der Einsatz lentiviraler Expressionsvektoren, um die shRNA-Expressionskassette effektiv in porcine Blastocysten transferieren zu können. Es gelang, ein entsprechendes auf HIV-1 basierendes lentivirales Vektorsystem herzustellen.

Durch Infektion mit solchen nicht-replizierenden Viren konnte die Expression von PERV in humanen, aber auch in primären porcinen Zellen um 90% inhibiert werden. Somit konnte erstmals die Hemmung endogener Retroviren mittels RNA-Interferenz gezeigt werden. Mit diesen Ergebnissen ist der Grundstein für die Herstellung entsprechender transgener Tiere gelegt.

Durch die Klonierung und Expression des p27Gag-Proteins und der Generierung spezifischer Antikörper gegen das rekombinante Gag-Protein, der Klonierung und Sequenzierung eines PERV-A/C Molekularklons, sowie der Durchführung mehrerer in vivo Infektionsversuche mit PERV wurden weitere Vorrausetzungen geschaffen, um das Risikopotential zukünftiger Xenotransplantationen hinsichtlich einer Virustransmission mit den porcinen endogenen Retroviren besser einschätzen zu können.